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本期，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生化平台高级工程师原丽华博士为流式人3iFlower分享流式分选样本制备经验之谈。

 流式分选样本制备

作者：原丽华 博士

单位：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生化平台

纳米生化平台目前有光学配置不同的两台BD FACS AriaII流式分选设备，都配置了单细胞分选装置。可以将任意数量的细胞分选到6、24、48、96、384孔板的每个孔中；或者1.5 mL、15 mL离心管、12 × 75 mm流式管。不同的是，当把细胞分选到6、24、48、96或384孔板时，只能进行单群体分选；而分到1.5 mL离心管，12 × 75 mm流式管，或

15 mL离心管则可以同时进行4路分选，就是同时把4个细胞亚群收集到不同的试管中。完成流式分选，首先需要制备合格，可以用于分选的样本。

 ——1—— 

 细胞密度 

下表是根据细胞类型和喷嘴大小整理出的细胞重悬密度。实际分选过程中细胞密度常规控制在1-20×106/mL之间；单细胞分选的细胞密度一般在

1-3×106/mL；这样可以兼顾细胞分选得率和细胞分选效率。上样重悬体积不要小于100μL。如果细胞样本个数不超过10000个，也可以进行分选，但上样体积控制在100μL。

 ——2—— 

 单细胞悬液 

样本推荐使用1×PBS w/ 0.1% BSA or 0.5% FCS进行重悬后上机；分选前细胞样本一定要经过45μm或者70μm滤网过滤，滤网孔径要小于喷嘴的大小，确保细胞是单细胞状态。对于容易结团的细胞样本，推荐以下样本缓冲液使用:

— 用不含钙和镁的PBS；

— 加入EDTA (2-5mM)；

— 如果细胞活性不佳，加25μg/ml DNAse I+5mM MgCL2 (no EDTA)用于消化死亡细胞释放的DNA；

— 加1% Accutase 在上样缓冲液中；

不要使用含血清的细胞培养基当作上样缓冲液。

 ——3—— 

 细胞收集容器 

FACS Aria II可以将细胞分选到1ml/1.5ml/12×75mm/15ml锥形离心管；或者6/24/48/96/384孔板中。

— 分选超过10%的细胞群体到样本管中，建议使用15ml离心管进行收集，离心管中提前加入5ml的分选缓冲液；

— 分选的细胞群小于原样本群体的10%，那么15ml的收集管加入10ml的分选缓冲液或采用12×75mm的流式管，装有1-2ml的缓冲液。

— 分选到96孔细胞培养板，分选前应在每个孔中放置100-200μl(建议200 μl)的缓冲液。

— 如果分选到96孔尖底的PCR管中，那需要提前加入4.5μL专门的裂解液

样本收集管排布：

— 1.5 ml 离心管 (两路或四路分选) ；

— 12×75mm流式管(两路或四路分选或3支12×75mm流式管加1支15ml离心管) ；

— 15ml离心管(两路分选或3个12×75mm加1个15ml离心管)；

 ——4—— 

 细胞染色 

分选样本的染色方法和流式分析样本基本一致，都建议加入死活染料对细胞活力进行鉴别，这在分选样本制备上尤其要求如此。

 ——5—— 

 对照设置 

阴性对照；阳性对照；Mock转染对照；处理对照；未处理对照；如果是

多色样本，那么还需要FMO对照。

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【参考文献】

1、Sample Preparation Guidelines for Cell Sorting. UWCCC Flow Cytometry Laboratory

2、Staining for sorting.

3、Sample Preparation for cell sorting.

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【作者简介】

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生化平台高级工程师 原丽华 博士

2010年博士毕业于上海交通大学生物医学工程专业，2011年在中国科学院苏州纳米所从事博士后研究，2013年进入纳米生化平台，负责搭建流式平台服务体系，代领团队完成细胞流式对外服务工作，建立了标准化流式服务体系，可以提供从药物研发和细胞治疗质量控制中流式的整体解决方案。

（本文编辑：刘立东KOL）

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