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李丕 邢江涛
代谢组学旨在对给定生物学背景下的所有代谢物（小分子）进行识别和定量。质谱法是对小分子进行准确分析的最强大工具之一，可以检测成百上千种代谢物。然而，由于数据库覆盖范围有限及代谢组的复杂性，通常只有不到30%的化合物被鉴定，而未注释的峰很可能是感兴趣化合物。因此未知物识别一直是代谢组学研究中最耗时的步骤，依赖质谱专家对数据进行劳动密集型的手动注释。
本文将从分辨率和质量精度、同位素过滤、CI确认、灵敏度、动态范围、解析软件这6个维度讨论GC-Orbitrap/MS在代谢组学中小分子识别和定量的表现。
01
未知物注释—— HRAM
近十年来随着 GC-Orbitrap/MS 高分辨气质系统的兴起，整个代谢组进入快速注释的新时代。这得益于GC-Orbitrap/MS超高分辨率（高达240K）和亚ppm质量精度的优点。采集样本生成高分辨质谱数据，然后利用离子质量亏损递推计算出未知峰所有可能的分子式。分辨率是分离两个m/z相近离子的能力，质量精度是实测值和理论值的偏差。分辨率和质量精度越高，满足筛选条件的分子式越少，越容易得到正确注释。
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Misra使用 GC-Orbitrap/MS 分析了标准参考物质 NIST SRM 1950 混合血浆参考样品，以评估该平台对常规发现代谢组学在代谢物注释和定量方面的适用性[1]。该研究分别通过EI、PCI 和 NCI 模式自信地鉴定了 263、93 和 65 种代谢物（代谢组学标准倡议MSI置信水平 2），其中 270 种代谢物 (64%) 使用内部谱库进行了验证。另外，与使用相同 NIST SRM 1950 血浆样品的已发表的基于LC-MS 的工作相比，两个平台只有 17% 的代谢物重叠，说明了血浆代谢组学研究中使用GC-Orbitrap/MS 平台的互补性和必要性。
02
未知物注释——同位素模式过滤
在高m/z区域，仅靠高质量精度不足以排除足够多的候选物，因为高m/z区域存在更多化学上可能的分子式。研究表明同位素模式正交过滤可以排除>95%的错误候选物。
Qiu使用加标的同位素比率离群值分析 (IROA) 进行未知代谢物注释[2]，并证明使用该工作流程生成化学式的可靠性更高。本质上，IROA 工作流程使用两种不同的 13C 富集碳源（随机 95% 12C 和 95% 13C）以产生镜像同位素峰对，二者的质量差异揭示了碳链长度 (n)，从而有助于鉴定内源性代谢物。通过GC-Orbitrap/MS数据可以识别 244 个 IROA 峰对，平均质量偏差为1.48 ppm，这显着提高了 IROA 的检测能力（Qiu 之前的工作使用其他类型的高分辨质谱，仅得到 126 个 IROA 峰对，平均质量偏差为 32.2 ppm）。
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03
未知物注释——EI+CI互补
元素组成的计算需要丰富的分子离子。EI谱图通常分子离子丰度低或缺失，因此需要使用 CI软电离获得分子离子信息。很多研究都使用GC-Orbitrap/MS 结合CI电离为显著失调的未知物生成可能的分子式，此处不赘述。
Misra在其研究论文中对GC-Orbitrap/MS轻松切换EI/CI源的功能给予了中肯评价。他提到，对于我们的高分辨 GC-Orbitrap/MS 仪器，EI 和 CI 之间的切换很容易，一个制备好的样品可以依次运行 EI-MS、PCI-MS/MS 和 NCI-MS分析。
赛默飞具有独特的VPI技术，可以在不破坏质谱真空的情况下2分钟之内切换EI源和CI源，5分钟内更换色谱柱，消除宕机时间，轻松实现EI/PCI联合定性或双柱RI定性。更有EI/CI混合离子源，一个离子源实现三种电离模式。
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04
高灵敏度——小样本量发现更多标志物
研究表明，GC-Orbitrap/MS在代谢组学中的灵敏度和发现标志物的数量远远高于四极杆质谱[3]。若要在两种仪器得到的响应强度相近的TIC，需要在 四极杆质谱上注入浓度高 8 倍的样品。以相同参数对数据进行峰拾取、分组、过滤后，分别剩下 114 个（四极杆）和 339 个化合物（GC-Orbitrap/MS）——这是 3 倍的差异。这表明GC-Orbitrap/MS的灵敏度更高，使用更小的样本量即可增加代谢覆盖率。
可用样本量对于环境样本或可扩展培养的生物体不是问题，但可能是人类或动物研究的限制因素。更重要的是，在样品浓度降低 8 倍的情况下，GC-Orbitrap/MS 仍检测生成了几乎 3 倍的代谢物。
比较两种仪器中显著失调的化合物，有趣的是，两个数据集的重要化合物只有 28% 重叠。在四极杆数据集中发现缺失46个失调化合物，而 GC-Orbitrap/MS 数据集仅缺失9个失调化合物。四极杆缺失的化合物中， 4个由于解卷积错误而缺失；12个由于p 值或倍数变化不符合重要化合物的阈值标准而缺失；29个因检测到的碎片太少缺失。由此可见，GC-Orbitrap/MS 可以检测到更多的化合物，因为它的检测限较低。此外，GC-Orbitrap/MS缺失的9种化合物中有2个被排除是因为它们存在于培养基空白中；2个解卷积错误缺失，5个因 p 值或倍数变化不符合重要化合物的阈值标准。
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05
动态范围
代谢组学的一个关键挑战是生物样品中代谢物浓度的动态范围较大，跨越4-6 个数量级。对于传统光电倍增器式质谱检测器，很容易导致饱和。
GC-Orbitrap/MS是一种新型高分辨质谱仪，动态范围高达6个数量级。因此GC-Orbitrap/MS允许引入更多的样品，从而获得更多的低丰度代谢物。在Qiu的研究中，GC-Orbitrap/MS 具有更宽的动态范围，因此可以检测到更多的 IROA 峰对，结合GC-Orbitrap/MS的高分辨率，共同提高了分子式的可靠性。
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呼吸气检测可以揭示人体的挥发性代谢组，是疾病早期诊断和精准医学的有效工具。Boyle采用热脱附（TD）与 GC-Orbitrap/MS 联用搭建Breath Biopsy呼吸活检平台（Owlstone Medical），将呼吸样本收集、热解吸和测量联系起来，以提供呼吸样本的综合概况。GC-Orbitrap/MS 高分辨率质谱仪与呼吸活检结合使用的主要优势在于动态范围宽、质量分辨率高和质量准确度高，可实现低浓度和高浓度下的检测和定量以及快速可靠的化合物鉴定。同一呼吸样本中可能含有非常高和超痕量（飞克）水平的化合物，因此获取广泛丰度范围内的高质量数据至关重要。超过6个数量级动态范围使 GC-Orbitrap/MS 轻松胜任呼吸活检（见下图）。
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另外，呼吸分析通常受到样本数量的限制，因此必须从单一分析中收集定量和定性信息。GC-Orbitrap/MS能够进行平行的靶向和非靶向分析，从而研究已知和潜在的新型生物标志物。
06
软件
软件与仪器本身同样重要，是成功鉴定化合物的基石之一。质谱硬件当下处于非常先进的阶段，结构解析的最终成功在于如何深度利用数据。这就要求开发更好的软件程序，以及评估HRAM MS数据的复杂工具。
GC-Orbitrap/MS配套赛默飞专业的数据解卷积、大队列的组学分析、和化合物质谱裂解软件。
组学分析软件Compound Discoverer内置高效靶向和非靶向分析工作流，帮助用户最大化从代谢组学样本中获得的代谢覆盖率和未知物质注释方面的信息，并可进行分子网络、代谢通路分析。
质谱裂解软件Mass Frontier包含3万多个裂解方案，其中包含十余万个反应和相关结构。可以执行直接分子搜索、子结构搜索、相似性搜索和名称搜索，并且所有关联的元数据都可以电子方式搜索，可用于开发计算机碎片预测。
Mass Frontier质谱裂解软件一瞥（从手绘到电子检索预测）（点击查看大图）
总结
在代谢组学领域，GC-Orbitrap/MS被积极用于捕获各种生物学背景的挥发性、非极性和极性（衍生）小分子。短短几年，大量研究工作使用 GC-Orbitrap/MS生成了令人兴奋的高通量和高质量的数据，涵盖基础研究到应用研究领域。通过靶向和非靶向工作流程，GC-Orbitrap/MS有望提供高质量的数据集，以应对各种研究挑战。
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